二級生物安全柜同一級生物安全柜一樣，氣體也是從外部流入二級生物安全柜，通常稱為進流。進流能夠防止微生物操作時產生的氣溶膠從安全柜前面操作窗口逃逸到實驗室內。然而，它們不同于一級生物安全柜之處為，只讓經HEPA過濾的（無菌的）空氣流過工作臺面。內置風機將空氣經前面的開口引入安全柜內并進入前面的進風格柵。因此沒有經過過濾器過濾的空氣不會直接進入工作區，從而保護安全柜內部存放的樣品和儀器不被外界空氣所污染。

二級生物安全柜的一個獨有特征就是由垂直層狀薄片的(無定向的)HEPA過濾器過濾后，再安全柜內部形成向下流動的氣流。氣流不斷地沖能可產生空氣傳播感染的安全柜內部，從而避面存放在柜體內的樣品受到感染。這樣的氣流被稱作下沉氣流。

不同型號的二級生物安全柜的主要區別在于：排氣的比例以及氣體經過空氣高壓再循環的比例不同。另外，不同的二級生物安全柜具有不同的排氣方式：有的安全柜將空氣過濾后直接排到室內，有的是通過連接到專用通風管道上的套管或通過建筑物的排風系統排到建筑物外面。

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